为了提高PE的产量,我们采用了两代种子活化法.根据有关PE基因调控、细菌生长代谢等文章所提到的影响PE合成的多种因素,对培养基成分和培养方法进行了适当调整.文章报道采用细菌生长和产毒分开的两步法,生长培养基加铁,产毒培养基去铁,细菌在转换培养基过程中洗涤两次,能解决细菌生长需铁而PE产生受铁抑制的矛盾,使PE产量提高10倍。
我们重复以上实验,并未发现PE产量有大幅度提高,与我们采用1μmolL铁离子浓度的生长、产毒培养基所产生的PE量无明显差异,可能此法在4℃洗菌去铁过程中,影响了细菌生长代谢的连续性,导致PE产量下降.为了增加PE转录,我们加大了产毒培养基中甘油的用量,从以前的1%提高到2%,并通过培养基中加入葡萄糖来促进细菌的有氧氧化和生长。为了使PE分泌后不马上被降解,我们在培养基中加入了0.191%的NTA以抑制胞外蛋白酶活性。
通过综合改进,使最终产毒量有大幅度提高,每毫升培养上清中PE蛋白达到96~192小鼠LD50和10μg,产毒水平不低于国外报道水平,培育时间比Lepple报告的18h缩短4~6h.采用Iglewski介绍方法制备了纯化PE,纯度达65.35μgmg蛋白和392.46LD50mg蛋白,经PDS-PAGE、琼脂糖扩散鉴定、细胞毒试验、小鼠致死试验等证明,我们获得了具有生物活性的PE制品,抗PE血清能完全中和PE的细胞毒作用,为主动和被动免疫控制绿脓感染提供了实验依据。目前,我们与兰州生物制品所协作制备出马抗PE血清可供进一步研究使用。